HPLC Method Optimization and Validation for Determination of Lycopene and Beta-carotene in Gac Fruit

Abstract

บทคัดย่อ วัตถุประสงค์: เพื่อหาสภาวะที่เหมาะสมในการวิเคราะห์และตรวจสอบความถูกต้องของวิธีวิเคราะห์ที่ได้พัฒนาในการตรวจสอบปริมาณไลโคปีนและเบตาแคโรทีนในเปลือก เนื้อ และรกหุ้มเมล็ดของผลฟักข้าว (Momordica cochinchinenssis Spreng., Family Cucurbitaceae) วิธิการศึกษา: การศึกษานี้ใช้เทคนิคโครมาโตกราฟีของเหลวสมรรถนะสูงแบบผันกลับ คอลัมน์ C18 อัตราการไหล 1.5 มิลลิลิตรต่อนาที ที่ 25 องศาเซลเซียส ปริมาตรที่ฉีด 20 ไมโครลิตร ตรวจวัดที่ความยาวคลื่น 475 นาโนเมตร และทดลองใช้เฟสเคลื่อนที่หลายชนิด ผลการศึกษา: พบว่าการใช้ อะซิโตไนไตรล์ต่อไดคลอโรมีเทน อัตราส่วน 75:25 โดยปริมาตร เป็นระบบที่เหมาะสมในการวิเคราะห์ โดยระบบการวิเคราะห์นี้มีความสามารถในการทำซ้ำได้ เห็นได้จากค่า %RSD ของไลโคปีนและเบตาแคโรทีนเท่ากับ 2.60 และ 3.87 ตามลำดับ มีค่าความถูกต้องแสดงในรูปของร้อยละการคืนกลับของไลโคปีนและเบตาแคโรทีนอยู่ในช่วง 99.59 – 103.20 และ 97.02 – 100.14 ตามลำดับ โดยใช้เวลาในการวิเคราะห์ 9 นาทีต่อตัวอย่าง และเวลาที่ใช้ในการชะไลโคปีนและเบตาแคโรทีนเท่ากับ 4.1 และ 6.5 นาที ตามลำดับ เมื่อนำวิธีการดังกล่าวไปใช้ในการวิเคราะห์ปริมาณไลโคปีนและเบตาแคโรทีนในผลฟักข้าว พบว่าพบปริมาณไลโคปีนมากที่สุดในรกหุ้มเมล็ด  (9.45 ± 0.27 มิลลิกรัมต่อกรัมน้ำหนักแห้ง) ตามด้วยเนื้อ (1.15 ± 0.06 มิลลิกรัมต่อกรัมน้ำหนักแห้ง) และเปลือก (0.74 ± 0.07 มิลลิกรัมต่อกรัมน้ำหนักแห้ง) สรุป: วิธีวิเคราะห์มีความจำเพาะ ความแม่นและความเที่ยง ตามหลักเกณฑ์การตรวจสอบความถูกต้อง AOAC guideline 2012 สามารถวิเคราะห์ปริมาณได้ในระยะเวลาสั้นซึ่งเป็นข้อดีในการใช้ต่อไปในอนาคต เช่น การวิเคราะห์ความคงตัว หรือควบคุมคุณภาพในการผลิตต่อไป คำสำคัญ: ฟักข้าว, ไลโคปีน, เบตาแคโรทีน, โครมาโตกราฟีของเหลวสมรรถนะสูงAbstract Objective: To optimize and validate an HPLC method for determination of lycopene and beta-carotene in peel, pulp and aril of gac fruit (Momordica cochinchinensis Spreng., Family Cucurbitaceae). Method: Reverse phase HPLC with a C18 column was used in this study. A flow rate of 1.5 mL/min, column temperature of 25°C, 20 µL of injection volume and detection wavelength (λ) of 475 nm was performed with various isocratic mobile phase system. Results: The most suitable mobile phase was acetonitrile: dichloromethane (75:25 v/v). The HPLC method showed sufficient reproducibility, i.e., %RSD for lycopene and beta-carotene was 2.60 and 3.87, respectively. The accuracy, i.e., %recovery, for lycopene and beta-carotene was in the range of 99.59 – 103.20% and 97.02 – 100.14%, respectively. The analysis took 9 minutes for a sample and retention time of peaks of lycopene and beta-carotene were 4.1 and 6.5 minutes, respectively. For the content of lycopene and beta-carotene in fully ripening gac fruit, the highest lycopene content was found in aril (9.45 ± 0.27 mg/g dry weight), followed by pulp (1.15 ± 0.06 mg/g dry weight) and peel (0.74 ± 0.07 mg/g dry weight). Conclusion: The method was proved to be specific, accurate and precise as indicated by AOAC guideline 2012. This validated method has provided a short run time per sample and it is advantageous for further studies such as stability of the extract or quality control in manufacturing industry. Keywords: Momordica cochinchinensis, Gac, lycopene, beta-carotene,  HPLC