การวิเคราะห์ด้วยโครมาโทกราฟีของเหลวสมรรถนะสูงและการสกัดด้วยตัวทำละลาย ของสารอิโมดินจากเถาวัลย์เหล็ก HPLC Analysis and Solvent Extraction of Emodin from Ventilago denticulata Willd

Abstract

บทคัดย่อ วัตถุประสงค์: 1) เพื่อพัฒนาและตรวจสอบความถูกต้องของวิธีวิเคราะห์อิโมดินจากสารสกัดเถาวัลย์เหล็กด้วยเทคนิค HPLC และ 2) เพื่อประเมินตัวทำละลายที่เหมาะสมในการสกัดสารอิโมดินจากเถาวัลย์เหล็ก วิธีการศึกษา: พัฒนาวิธีการวิเคราะห์ปริมาณอิโมดินที่สกัดจากเถาวัลย์เหล็กด้วยตัวทำละลายชนิดต่าง ๆ ด้วยเทคนิค HPLC-PDA โดยใช้คอลัมน์ XSelect CSH ชนิด C18 ขนาดอนุภาค 5 ไมโครเมตร ขนาด 4.6x250 มิลลิเมตร อุณหภูมิคอลัมน์ 30 องศาเซลเซียส สารละลายตัวพาเป็นสารละลายกรดฟอสฟอริกความเข้มข้นร้อยละ 0.1 และ อะเซโทไนไทรล์ผสมกันแบบเกรเดียน อัตราการไหล 1.0 มล./นาที และตรวจวัดด้วยโฟโตไดโอดแอเรย์ที่ความยาวคลื่น 288 นาโนเมตร ศึกษาความเหมาะสมของค่าคงที่ไดอิเล็กทริกของตัวทำละลายในการสกัดอิโมดินจากเถาวัลย์เหล็ก ศึกษาโดยหมักผงเถาวัลย์เหล็กนาน 7 วัน ด้วยตัวทำละลาย ได้แก่ น้ำ, เมธานอลความเข้มข้นร้อยละ 20 - 100, เอธานอลความเข้มข้นร้อยละ 20 - 100, โพรพานอล และ บิวธานอล ผลการศึกษา: อิโมดินให้พีคที่เวลาประมาณ 10.8 นาที โดยใช้เวลาวิเคราะห์ 20 นาทีต่อการฉีดแต่ละครั้ง พบว่าวิธีมีความจำเพาะกับอิโมดินสามารถแยกออกจากพีคข้างเคียงได้ พบความถูกต้องของวิธีด้วยค่าร้อยละการกลับคืนของอิโมดินที่ 101.99 ถึง 103.16 ค่าร้อยละของค่าเบี่ยงเบนมาตรฐานสัมพัทธ์เท่ากับ 0.09 ถึง 0.14 ปริมาณต่ำสุดของอิโมดินที่พบได้เป็น 0.008 มคก./มล. และปริมาณต่ำสุดที่ตรวจหาเชิงปริมาณได้เท่ากับ 0.02 มคก./มล. พบว่าตัวทำละลายที่สกัดได้อิโมดินปริมาณสูงที่ 500 ถึง 700 มก./กก. มีค่าคงที่ไดอิเล็กทริกอยู่ในช่วง 30 ถึง 50 โดยเอธานอลความเข้มข้นร้อยละ 60 ให้ปริมาณอิโมดินสูงที่สุดที่ 702.52 มก./กก. สรุป: วิธีวิเคราะห์ปริมาณอิโมดินมีความไว ความจำเพาะ ความแม่น และความเที่ยง ตามหลักเกณฑ์การตรวจสอบความถูกต้องของวิธีวิเคราะห์ของ ICH Guideline 2005 และ AOAC 2013 ตัวทำละลายที่เหมาะสม คือ เอธานอลความเข้มข้นร้อยละ 60 ซึ่งจะได้ปริมาณอิโมดินสูงที่สุดเพื่อนำไปแยกสารให้บริสุทธิ์และนำไปให้ประโยชน์ต่อไป คำสำคัญ: อิโมดิน, HPLC, เถาวัลย์เหล็ก, dielectric constant, การสกัดด้วยตัวทำละลายAbstract Objectives: 1) To develop and validate analytical method for determination of emodin content in V. denticulata extracts using HPLC, and 2) to evaluate a suitable solvent for emodin extraction from V. denticulata. Methods: HPLC-PDA method was developed for the determination of emodin from Ventilago denticulata Willd in various solvent extracts. Emodin was separated from an extract on a XSelect CSH-C18 (5 µm x 4.6 mm x 250 mm) column maintained at 30 °C, using 0.1% phosphoric acid solution and acetonitrile mixed by gradient system as a mobile phase, flow rate at 1.0 mL/min and photo diode array (PDA) detector at 288 nm. The relevance of dielectric constant of solvents and emodin content extracted from V. denticulata was studied. The dried herbs were macerated with water, 20 - 100% methanol, 20 - 100% ethanol, 1-propanol and 1-butanol for 7 days. Results: The chromatogram showed emodin peak at about 10.6 min. with a run time of 20 min. per injection. The specificity and selectivity parameters were proved by good separation of emodin from other compounds. The developed method was accurate and precise as shown by % recoveries of 101.99 - 103.16% and % relative standard deviation of 0.09 - 0.14%. The limit of detection (LOD) and limit of quantitation (LOQ) were 0.008 and 0.02 µg/mL, respectively. The correlation between emodin content and dielectric constant of extracted solvents was parabolic. The dielectric constant between 30 - 50 yielded the emodin content in the range of 500 - 700 mg/kg of dried weight. 60% ethanol provided the highest emodin content with 702.52 mg/kg dried weight. Conclusion: The developed HPLC analysis on emodin was sensitive, specific, accurate, and precise as indicated by the ICH 2005 guideline and AOAC 2013 guideline. 60% ethanol offered the highest amunt of emodin extracted from V. denticulata for furtther isolation and utilisation. Keywords: emodin, HPLC, Ventilago denticulata, dielectric constant, solvent extraction