การแยกและการศึกษาลักษณะของแบคทีเรียกรดแลคติกและเฟจของแบคทีเรียกรดแลคติกจากนมเปรี้ยว Isolation and Characterization of Lactic Acid Bacteria and Lactic Acid Bacteria Phages from Fermented Milk

Abstract

การติดเชื้อโดยแบคทีริโอเฟจหรือเฟจเป็นสาเหตุที่ทำให้สูญเสียอย่างมากทางเศรษฐกิจในอุตสาหกรรมการผลิตนมโดยโรงงานส่วนใหญ่ได้ประสบปัญหาการปนเปื้อนของเฟจอย่างรุนแรงซึ่งส่งผลให้การหมักล้มเหลวโรงงานบางแห่งในประเทศไทยได้มีการส่งตัวอย่างผลิตภัณฑ์นมเปรี้ยวให้บริษัทต่างประเทศเพื่อตรวจสอบการปนเปื้อนเฟจแต่ข้อมูลเกี่ยวกับเฟจที่พบในโรงงานของไทยนั้นยังไม่มีเพียงพอ จากความสำคัญดังกล่าวในงานวิจัยนี้จึงเน้นถึงการแยกและศึกษาลักษณะของเฟจที่ติดเชื้อในแบคทีเรียกรดแลคติกจากผลิตภัณฑ์นมเปรี้ยวที่มาจากการหมักล้มเหลวในโรงงานของไทยจากการศึกษา พบว่า สามารถแยกแบคทีเรียกรดแลคติกได้ 1 ไอโซเลท เมื่อจัดจำแนกโฮสต์โดยการเปรียบเทียบลำดับเบสบริเวณ 16S rDNA ของโฮสต์กับฐานข้อมูล GenBank พบว่า มีความคล้ายคลึงกับ Lactobacillusplantarum ถึง 100%  และเมื่อแยก  เฟจจากเทคนิคการทำอาหารวุ้น 2ชั้น พบพลาคขนาดเล็กและมีลักษณะใส และให้ชื่อเฟจนี้ว่า T 25 จากการศึกษาลักษณะทางสัณฐานวิทยาของเฟจT 25 ภายใต้กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องผ่านพบว่า เฟจ T25 มีส่วนหัวเป็นรูปหกเหลี่ยม โดยมีขนาดเส้นผ่านศูนย์กลางของส่วนหัวเท่ากับ60 นาโนเมตร และมีส่วนหางที่ยืดหดไม่ได้ขนาด 225 นาโนเมตร ดังนั้นจึงจัดจำแนกเฟจนี้อยู่ในแฟมิลี Siphoviridae จากการศึกษา one-step growth kinetic พบว่า เฟจ T 25 มี latentperiod เท่ากับ 20 นาที เมื่อนำมาศึกษาสมบัติของเฟจในการติดเชื้อกับแบคทีเรียกรดแลคติกสปีชีส์อื่นและจีนัสอื่นพบว่า เฟจ T 25 ไม่สามารถทำให้เกิดการติดเชื้อข้ามไปยังแบคทีเรียกรดแลคติกสายพันธุ์อื่นและจีนัสอื่นที่นำมาทดสอบได้ ซึ่งการศึกษาด้านชีวโมเลกุลยังพบว่า เฟจมีขนาดดีเอ็นเอโดยประมาณเท่ากับ 44 kb นอกจากนี้ยังพบว่าไดวาเลนท์แคทไอออน (CaCl2) ที่ความเข้มข้น 30 มิลลิโมลาร์ มีผลต่อการเข้าเกาะติดโฮสต์ของเฟจ เฟจ T 25 สามารถทนต่ออุณหภูมิสูงถึง72 องศาเซลเซียสได้ และยังสามารถทนต่อ pH ในช่วง 4.0-10.0 ดังนั้นจากคุณสมบัติทั้งหมดของเฟจที่ได้มาจากการศึกษาครั้งนี้ จึงสรุปได้ว่าเฟจ T25 ไม่สามารถถูกทำลายด้วยอุณหภูมิพาสเจอร์ไรซ์ และการปรับ pHได้ ดังนั้น จึงควรมีการพัฒนาวิธีอื่นๆเพื่อลดการปนเปื้อนและควบคุมเฟจต่อไปได้อย่างมีประสิทธิภาพInfections by bacteriophages or phages can lead to great economic losses in the dairyindustries.  Most of the dairy plants haveencountered severe phage contamination, which resulting in fermentationfailure. Some Thai factories have sent the samples oftheir fermented milk products to oversea companies for detecting phage contamination. However, the characteristics of phages found in Thai factoriesare not well elucidated. Hence, this study aimed to isolate and characterizethe phages of lactic acid bacteria (LAB) from the milk productsacquired from fail fermentation in Thai factories.  The results showed that only 1 isolate of LABwas obtained. This LAB was identified by 16S rDNA sequence analysis and BLAST searching within the GenBank database which revealingthat it possessed 100% similarity to Lactobacillusplantarum. When using double agarlayer techniques for phage isolation, the small and clear plaques were produced bythe phage which was named as T 25. Electron micrographs showed that T 25phage was found to have hexagonal head (60 nm in diameter) and longnoncontractile tail (225 nm in length), indicating that it belonged toSiphoviridae family. From the study of one-step growth kinetics, the resultsshowed that T 25 phage had the latent period of 20 min. The host-rangedetermination found that this T 25 phage was incapable of cross-infection toother genus or species of tested LAB. The molecular characterization of T 25showed that it had molecular weight of approximately 44kb. Furthermore, the addition of divalent cations (CaCl2) at 30 mM was found to affect phageadsorption to their hosts. Also, this phage wasshown to be capable of surviving at temperature as high as 72°C and pH ranging from 4.0to 10.0. In conclusion, from the characteristics of T 25 phage, the resultssuggested that pasteurization temperature and pH adjustment were incapable ofdestroying this phage. Therefore, other methods for effective decontaminationand controlling this phage should be further determined.