A Simple and Efficient Method for Partial Purification of Yellow Head Virus

Abstract

บทคัดย่อ   การทำให้อนุภาคไวรัสที่สมบูรณ์บริสุทธิ์เป็นสิ่งจำเป็นสำหรับการวิจัยที่เกี่ยวกับการติดเชื้อไวรัส ในงานวิจัยนี้ได้พัฒนาวิธีการทำไวรัสหัวเหลืองให้บริสุทธิ์จากเหงือกกุ้งกุลาดำที่ติดเชื้อให้ง่ายและมีประสิทธิภาพ วิธีการทำให้บริสุทธิ์นี้ไม่จำเป็นต้องใช้การปั่นเหวี่ยงแบบเดนซิตีเกรเดียนและเครื่องอัลตราเซนตริฟิวส์ เริ่มจากนำเหงือกกุ้งที่ติดเชื้อไวรัสหัวเหลืองไปบดและนำไปปั่นเหวี่ยงเพื่อกำจัดเศษเซลล์ นำส่วนที่เป็นสารละลายใสจากเหงือกไปกรองผ่านตัวกรองที่มีรูพรุนขนาด 0.45 ไมโครเมตรและปั่นเหวี่ยงเพื่อเก็บไวรัสหัวเหลือง ทำการตรวจสอบไวรัสหัวเหลืองที่บริสุทธิ์ด้วยเทคนิค SDS-PAGE พบโปรตีนโครงสร้างของไวรัสอย่างน้อย 3 ชนิด ได้แก่ จีพี116, จีพี64 และ พี20 จากนั้นทำการตรวจสอบความสมบูรณ์ของไวรัสภายใต้กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องผ่าน หาปริมาณไวรัสโดยใช้เทคนิครีเวิร์สทรานสคริปชั่นเรียลไทม์พีซีอาร์ (real-time RT-PCR) พบว่ามีปริมาณ 6.53 × 107 ก๊อปปี้ต่อไมโครลิตร ประเมินความรุนแรงเชื้อไวรัสหัวเหลือง โดยกุ้งที่ฉีดไวรัสหัวเหลืองที่บริสุทธิ์มีอัตราการตาย 100% ภายใน 3 วัน หลังจากได้รับเชื้อ นอกจากนี้การบ่มไวรัสหัวเหลืองที่บริสุทธิ์กับเซลล์แมลง Sf9 พบการแสดงออกของยีนไวรัสจีพี64 ซึ่งแสดงถึงการติดเชื้อไวรัสของเซลล์ Sf9 ดังนั้นวิธีการทำให้บริสุทธิ์บางส่วนของไวรัสหัวเหลืองด้วยวิธีนี้มีประสิทธิภาพเพียงพอที่จะนำไปใช้ในการงานวิจัยทางด้านโรคติดเชื้อไวรัสหัวเหลือง   คำสำคัญ: ไวรัสหัวเหลือง, การทำให้บริสุทธิ์บางส่วนของไวรัส, กุ้งกุลาดำ ABSTRACT Purification of mature viral particles is needed for the research involving in viral infections. Herein, a simple and efficient purification method for yellow head virus (YHV) from Penaeus monodon-infected gill is developed. This purification method does not require the density gradient centrifugation and ultracentrifugation. The YHV-infected gills were homogenized and centrifuged to remove the cell debris. The gill lysate was filtered through 0.45 µm membrane filter and centrifuged to collect the YHV. The partial purified YHV was verified by SDS-PAGE technique. At least 3 viral structural proteins of GP116, GP64 and P20 were detected. The intact virion was also observed under a transmission electron microscope. The purified YHV was quantified using real-time reverse transcription PCR (real-time RT-PCR) technique. The preparation was found to contain 6.53 × 107 copies per microliter. The virulence of purified YHV was evaluated. The shrimp injected with the purified YHV resulted in 100% mortality within three days. Moreover, the incubation of purified YHV with Sf9 insect cell line showed the expression of viral gene, gp64, indicating the viral infection of Sf9 cell. Thus, the partial purification method of YHV was efficient and convenient to be used for the research in YHV disease.   Keywords: Yellow head virus, Virus partial purification, Penaeus monodon