ผลของดีคาร์บอกซีเลชั่นของกรดอะมิโนร่วมกันในการปรับปรุงอาหารไฮโดรเจนซัลไฟด์สำหรับการตรวจวิเคราะห์ซัลโมเนลลากลุ่มที่สามารถรีดิวซ์ไทโอซัลเฟตเบื้องต้น

Abstract

โรงงานอุตสาหกรรมอาหารต้องการวิธีการวิเคราะห์ที่รวดเร็วและเชื่อถือได้ สามารถทำได้สะดวกและค่าใช้จ่ายไม่สูงเพื่อใช้ในการตรวจสอบการปนเปื้อนของ Salmonella spp. เบื้องต้น งานวิจัยนี้จึงได้พัฒนาอาหารบ่งชี้การเกิดไฮโดรเจนซัลไฟด์ (H2S) พร้อมวิธีทดสอบในเพลทระดับไมโครเวล สำหรับการตรวจหาซัลโมเนลลาเบื้องต้นอย่างรวดเร็ว งานวิจัยนี้ได้ศึกษาผลของการใช้ดีคาร์บอกซีเลชั่นของกรดอะมิโนร่วมกันต่อการเพิ่มขึ้นของการเกิดตะกอนสีดำในรูปแบบอาหารเหลวบ่งชี้ก๊าซ H2S (หรือ TFX) ร่วมกับไลซีน-ออร์นิทีน (TFXLO), ออร์นิทีน-อาร์จินิน (TFXOA) หรือไลซีน-อาร์จินีน (TFXLA) เพื่อปรับปรุงพัฒนาการเกิดไฮโดรเจนซัลไฟด์และการเกิดตะกอนสีดำที่เด่นชัด โดยทดสอบกับซัลโมเนลลาที่สามารถเกิดปฏิกิริยา H2S+ จำนวน 7 สายพันธุ์และซัลโมเนลลาที่ไม่สามารถเกิดปฏิกิริยา H2S+ ได้ รวมถึงเชื้อที่ไม่ใช่ซัลโมเนลลาจำนวนรวม 13 สายพันธุ์ อาหารเหลว TFX ที่ใส่ไลซีน (TFXL) เป็นอาหารควบคุม ปฏิกิริยาการเกิดตะกอนสีดำเป็นอินดิเคเตอร์สามารถตรวจติดตามจากการวัดค่าการดูดกลืนแสง (OD650) ที่เปลี่ยนแปลงไปและด้วยตาเปล่า ผลการวิจัยพบว่าส่วนเสริมที่ใส่ลงไปร่วมกับกรดอะมิโนให้ผลการตกตะกอนของเฟอรัสซัลไฟด์ที่แตกต่างกันและให้ค่าการดูดกลืนแสง OD650 ขึ้นอยู่กับซีโรวาร์ของซัลโมเนลลา การเกิดตะกอนสีดำของซัลโมเนลลามีความเข้มและคมชัดมากขึ้นเมื่อมีการปรับปรุงสูตรกรดอะมิโน โดยเฉพาะอาหารเหลวที่มีการใช้ออร์นีทีน-อาร์จินีนร่วมกัน ซึ่งจะให้ค่าการดูดกลืนแสงที่ 650 นาโนเมตร (OD650 = 1.7 – 2.5) เปรียบเทียบกับการใช้ไลซีนเพียงตัวเดียว (OD650 = 1.4 – 2.1) ปกติแล้วระบบไทโอซัลเฟต-เฟอร์ริกแอมโมเนียมซิเตรทนี้มักพบการเกิดตะกอนสีดำในซัลโมเนลลากลุ่มพิเศษ (Salmonella Anatum และ Salmonella Typhi) ค่อนข้างน้อย แต่เมื่อใช้ไลซีน-อาร์จินีนร่วมกัน มีผลช่วยเพิ่มความเข้มของอาหารเหลวไฮโดรเจนซัลไฟด์ จากที่ให้ค่า OD650 ที่ต่ำที่ 0.9 เพิ่มเป็น 1.6 ใน S. Anatum ได้ อย่างไรก็ตาม สำหรับ S. Typhi ยังไม่มีการใช้กรดอะมิโนร่วมกันสูตรใดที่สามารถปรับปรุงการเกิดไฮโดรเจนซัลไฟด์ได้ อาหารเหลวบ่งชี้ไฮโดรเจนซัลไฟด์ทุกสูตรสามารถแยกซัลโมเนลลาที่ไม่สามารถเกิดไทโอซัลเฟตรีดิวซ์ซิ่งออกจากซัลโมเนลลาสายพันธุ์ปกติได้ แต่ยังไม่สามารถแยกเชื้อแข่งขันของซัลโมเนลลาได้ ยกเว้น Citrobacter freundii สามารถแยกได้ในอาหารเหลวสูตร TFXL โดยสรุปการใช้ออร์นิทีนและอาร์จินินเป็นสารอาหารพื้นฐานนั้น สามารถปรับปรุงระบบการเกิดปฏิกริยาไฮโดรเจนซัลไฟด์ให้ชัดเจนขึ้น อาหารเหลวบ่งชี้การเกิดปฏิกิริยาการเกิดไฮโดรเจนซัลไฟด์นั้นนับเป็นอาหารเหลวทางเลือกโดยเวลาที่ใช้ในการตรวจวิเคราะห์ทั้งหมดสำหรับผลการตรวจวิเคราะห์เบื้องต้นสั้นลงและรวดเร็วกว่าวิธีวิเคราะห์แบบทั่วไปที่ใช้เวลาถึง 48 ชั่วโมงคำสำคัญ: ดีคาร์บอกซีเลชั่นของกรดอะมิโน  การสร้างไฮโดรเจนซัลไฟด์  วิธีการไมโครเพลท  การตรวจหาซัลโมเนลลาเบื้องต้นThe food industry needs rapid and reliable methods that are convenient and cost-effective as primary screens for routine inspections of Salmonella spp. contamination. To fulfil Salmonella screening step, hydrogen sulfide (H2S) indicator medium was proposed and tested in a microwell plate. Method: The combined effect of amino acid decarboxylation on the increase of black precipitation, H2S indicator broth (TFX) plus with lysine-ornithine (TFXLO), ornithine-arginine (TFXOA), or lysine-arginine (TFXLA) were studied in seven H2S+ Salmonella serovars and thirteen non-salmonellae Salmonella and non-salmonellae to improve hydrogen sulfide production and black precipitation contrast. The TFX broth containing lysine (TFXL) was compared as control. The black precipitates, as indicator of the reaction were followed by optical density (OD650) changes and visualization. Result:Different supplement with combined amino acids provided different ferrous sulfide precipitates and OD650 signals depending on Salmonella serovars. The black precipitates of all typical Salmonella had improved with more contrast in all combined amino acids, especially ornithine-arginine based broth (OD650=1.7–2.5), compared to single lysine usage (OD650=1.4–2.1). Thiosulfate-ferric ammonium citrate system commonly provided ineffective results for black precipitates in atypical Salmonella (Salmonella Anatum and Salmonella Typhi). The lysine-arginine combined effect could fix the low H2S contrast OD650 from 0.9 to 1.6 in S. Anatum. However, none of combined amino acids was able to improve hydrogen sulfide production in atypical S. Typhi. All H2S enrichment media could differentiate all non-thiosulfate reducing salmonellae competitors tested out of Salmonella. There was no differentiation of three H2S+Salmonella competitors from Salmonella in any media, except Citrobacter freundii in TFXL broth. Conclusion: The selected ornithine and arginine as the nutrient base was noted for further improvement in hydrogen sulphide reaction system. With applying H2S indicator media alternative to conventional selective broths, the total detection time for presumptive results was shortened; more rapid than conventional protocol for up to 48 h.Keyword: Amino acid decarboxylation, Hydrogen sulfide production, Microplate assay, Salmonella presumptive screening