การหาสภาวะที่เหมาะสมในขั้นตอนการเพิ่มจำนวนเพื่อปรับปรุงการคัดเลือกเชื้อลิสทีเรีย (MEDIA OPTIMIZATION OF ENRICHMENT PROTOCOL TO IMPROVE LISTERIA SELECTIVITY)

Abstract

งานวิจัยนี้เป็นการศึกษาการเจริญเติบโตและการคัดเลือกเชื้อลิสทีเรียอินโนคัวในขั้นตอนการเพิ่มจำนวนแบบคัดเลือก เพื่อสร้างความรู้พื้นฐานในการเพิ่มประสิทธิภาพให้กับขั้นตอนการตรวจเชื้อลิสทีเรีย ทั้งนี้ใช้เชื้อแอลอินโนคัวซึ่งเป็นเชื้อไม่ก่อโรคเป็นเชื้อทดสอบ เนื่องจากเชื้อแอลอินโนคัวมีลักษณะทางสรีรวิทยาใกล้เคียงกับเชื้อลิสทีเรียโมโนไซโตจีเนส สำหรับการทดลองได้ทำการเปรียบเทียบการเจริญของเชื้อแอลอินโนคัวบนอาหารเลี้ยงเชื้อเหลวที่ใช้กันอยู่ทั่วไป ได้แก่ ทีเอสบี โดยในขั้นตอนการเพิ่มจำนวนแบบไม่คัดเลือกของเชื้อแอลอินโนคัวร่วมกับการศึกษาผลของสารยับยั้งสำหรับการตรวจพบเชื้อแอลอินโนคัว การศึกษาผลของสารยับยั้งสำหรับการตรวจพบเชื้อลิสทีเรีย สารยับยั้งที่แนะนำให้ใช้ในการตรวจเชื้อตามวิธีมาตรฐานทั่วไป ได้แก่ เอ็นจีเอฟไอเอส ไอดีเอฟ ยูเอส เอฟดีเอ เอ็นเอ็มเคแอล ไอเอสโอ เอโอเอซี และยูเอสดีเอ-เอฟเอสไอเอส ทำการทดลองโดยเติมสารคัดเลือกสำหรับเชื้อลิสทีเรียที่ใช้ทั่วไปในอาหารเลี้ยงเชื้อเหลว ทีเอสบี เพื่อศึกษาการเจริญและการคัดเลือกเชื้อลิสทีเรีย ผลการวิจัยจากกราฟการเจริญของเชื้อพบว่า อคริฟลาวีน มีผลต่อการเจริญของเชื้อแบคทีเรียแกรมบวกอย่างมีนัยสำคัญ เชื้อแอลอินโนคัว สามารถทนต่ออคริฟลาวีน ได้น้อยกว่าเชื้อสแต็ปฟีโลคอกคัสออเรียส ในทางตรงกันข้าม โพลีมัยซิน บี มีประสิทธิภาพในการยับยั้งเชื้อแบคทีเรียได้ทั้งแกรมลบและแกรมบวก แต่ยับยั้งเชื้อแบคทีเรียแกรมบวกได้น้อยกว่า โดยโพลีมัยซิน บี ที่ความเข้มข้น 10 มิลลิกรัม/ลิตร ซึ่งเป็นความเข้มข้นต่ำที่สุดในการศึกษา มีประสิทธิภาพในการยับยั้งเชื้อ อี โคไล จาก 6 ล็อก ซีเอฟยู/มิลลิลิตร ให้ลดลงเหลือน้อยกว่า 2 ล็อก ซีเอฟยู/มิลลิลิตร ภายในระยะเวลาการบ่ม 2 ชั่วโมง กรดนาลิซิดิกมีประสิทธิภาพในการยับยั้งแบคทีเรียแกรมลบเท่านั้น และมีประสิทธิภาพน้อยกว่า โพลีมัยซิน บี ในกรณีของลิเธียมคลอไรด์ ถึงแม้จะไม่มีผลในการยับยั้งเชื้อจุลชีพเป้าหมาย แต่ยังคงใช้ ลิเธียมคลอไรด์ร่วมในการทดลองด้วย ในส่วนของการหาสภาวะที่เหมาะสมของส่วนผสมสารคัดเลือก ทำการทดลองโดยการวิเคราะห์พื้นที่ผิวตอบสนองและสรุปได้ว่าส่วนผสมของสารคัดเลือกที่เหมาะสมสำหรับการแยกเชื้อ อี โคไล และเชื้อเอสออเรียส ออกจากเชื้อแอลอินโนคัว คือการใช้อคริฟลาวีน 5.7 มิลลิกรัม/ลิตร โพลีมัยซิน บี 10 มิลลิกรัม/ลิตร ลิเธียมคลอไรด์ 20.7 มิลลิกรัม/ลิตรคำสำคัญ: การคัดเลือกเชื้อลิสทีเรีย  ลิสทีเรีย อินโนคัว  การเพิ่มจำนวน  สารยับยั้งListeria innocua growth and selectivity during selective enrichment step were studied to formulate fundamental knowledge to enhance Listeria spp. detection protocol. L. innocua was used in this study as a non-pathogenic Listeria model because it shares similar physiological traits with Listeria monocytogenes. TSB, an effective non-selective enrichment medium, was selected to enhance the growth of L. innocua in the selective enrichment step. The effects of conventional inhibitors were studied by using common selective inhibitors suggested in most global microbiological detection standards (i.e., NGFIS, IDF, USFDA, NMKL, ISO, AOAC, and USDA-FSIS). The TSB broth base was modified by adding some conventional selective agents to study the growth and selectivity of Listeria spp. The growth profiles showed that acriflavine significantly affected the growth of Gram-positive bacteria. Polymyxin B inhibited Gram-negative bacteria as well as Gram-positive bacteria but to a lesser extent. As low as 10 mg/L of Polymyxin enabled effective reduction of E. coli from 6 to less than 2 log CFU/mL within 2 h of incubation. Nalidixic acid only suppressed Gram-negative bacteria and was not as effective as Polymyxin B. Although lithium chloride did not significantly affect the inhibition of any target microorganisms. Response surface analysis indicated that the optimum selective agents included 5.7 mg/L of acriflavine, 10.0 mg/L of Polymyxin B and 20.7 g/L of lithium chloride. This new media formula was proved to isolate E. coli and S. aureus from L. innocua.Keywords: Listeria Selectivity, Listeria innocua, Enrichment Media, Selective Agents